Tris-HCl緩沖液用于蛋白純化中需要注意的問題
近期,很多實驗室會在蛋白純化過程中使用生物緩沖液,此時挑選適合的緩沖劑就顯得格外重要。很多人會特別挑選Tris一類的,認(rèn)為離子強度低,緩沖能力強,其PH值接近生理范圍,是蛋白的良好溶劑。但其實Tris-HCl緩沖液也可以用于蛋白純化,只不過為了保證純化效果,在實驗過程中還是需要注意一些問題。
一、注意Tris-HCl的濃度
在純化實驗中確定了緩沖液的pH值和Tris-HCl的緩沖體系,就能知曉它設(shè)定的PH緩沖作用,通常情況下緩沖劑解離常數(shù)pKa在設(shè)定pH值上下一個單位內(nèi)具有緩沖作用。僅僅只有緩沖范圍和解離常數(shù)復(fù)合遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠,另外還需確保緩沖液Tris-HCl的濃度足夠高,才能起到實際效果,一般濃度為20-100mM。
二、注意Tris-HCl對溫度的敏感度
Tris系列的緩沖體系對溫度都比較敏感,比如在25℃時將Tris-HCl調(diào)至pH為8,pH值將在5℃時增加到8.58,而在37℃時降到7.71。因此在4℃條件下保存蛋白或在37℃進(jìn)行實驗,就應(yīng)該考慮到室溫下調(diào)的pH值可能在實驗條件中是否適用。
三、注意Tris-HCl緩沖液中的鹽
蛋白純化實驗中用Tris-HCl緩沖液,需要添加氯化鈉以提高鹽濃度,以協(xié)助維持蛋白的可溶性和模擬生理條件,一般常用濃度150mM。離子交換層析進(jìn)行蛋白純化開始時,需降低鹽濃度減少競爭,凝膠過濾柱和Ni2+親和層析柱則需提高濃度。緩沖液體系對蛋白的活性不會有干擾,Tris-HCl中不能含有磷酸鹽,否則就會抑制某些蛋白的活性,反應(yīng)前會徹底透析掉。